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ChIP-seqの統計解析のレビュー読んだよ2

今回読む論文はこれ。

3. Pepke, S., & Wold, B. (2009). Computation for ChIP-seq and RNA-seq studies. Nature method

ChIP-seq について体系的に書かれているレビュー。現在出版されているレビューのなかでは一番良いと思う。

ChIP-seq の概要


ChIP-seq を成否は、
1. 十分に binding site が enrich されていること
2. enrich されたクロマチン分子を獲得できていること
の2点に依存する。

mapping は specificity (unique reads only) と increasing sensitivity (multireads used) のトレードオフがある。ChIP reactions は enrichments であって purifications ではない(`・ω・´)キリッ Background と真のシグナルを分ける必要がある。哺乳類ゲノムは大きいので background の coverage が低いことに注意する。単純な tag count が多いピークに生物学的な意味があるとは限らない。バックグラウンドやコントロールとの比較する。いろんなツールやパラメータを試して変化のないピークをつかうべき。

ChIP peak の分類


sequence specific tf だと特定の位置に鋭いピークが立つ。RNA polymerase はTSSに強く鋭いピークがでるが gene body にも broad なシグナルがでる。Histone などの場合は nucleosome level の broad なピークが続く。それぞれ別なアルゴリズムやパラメータで検出しなければならない。

Peak finding の用語整理と解析の流れ


まずは用語の説明。ホワイトボードにメモった手書きの図をアップしておく。read を reference genome に mapping すると1塩基ごとの tag count が計算できる。この tag count から binding site を得る問題を解く。この際に、tag count から分布に変換する処理を peak calling や peak finding と総称する。

tag の密度高い領域を region と呼び background と比較して enrich した領域のことを言う。region を同定したあと、タンパク質とDNAがクロスリンクした場所を特定する。これを source point と呼ぶ。region のなかで tag count が極大になる部分が source point である可能性が高い。この場所を summit と呼ぶ。histone mark などは single source point が存在するわけではないので summit finding の必要はなく、region finding のみでよい。ChIP-seq でよくみるタグカウントの分布を単に peak と言ったり single peak profile と呼ぶらしい。(が、後者は、時系列などの peak の変遷と混同しそうなので使いたくないなー)

ChIP-seq Peak Finding

次に解析の流れ。
1. single peak profile の決定
2. background の調整 (異なる実験間の peak pairing も必要だが言及なし)
3. peak calling criteria
4. artifact などを除く peak filtering
5. peak ranking
となる。

次回はそれぞれのステップについて詳しく説明する。

100報まで残り 97.5報。

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シーケンスアダプタ配列除去ツールまとめ

FASTQ/A file からシーケンスアダプター配列やプライマー配列を除くためのプログラムをまとめてみる。

まず、配列の除去には大別して2つの方向性がある。ひとつは、アダプター配列を含む「リード」を除いてしまう方法。もうひとつは除きたい配列をリードからトリムする方法である。後者のほうが有効リードが増えるメリットが、綺麗に除ききれない場合は、ゲノムへのマップ率が下がる。
気をつける点としては、アダプター/プライマーの reverse complement を検索するかどうか。paired end の際には大事になる。クオリティでトリムできるものや、Paired-end を考慮するものなどもある。アダプター/プライマー配列の文字列を引数として直接入力するものと、multi fasta 形式で指定できるももある。

From Evernote: シーケンスアダプタ配列除去ツールまとめTagDust
http://genome.gsc.riken.jp/osc/english/software/src/nexalign-1.3.5.tgz http://bioinformatics.oxfordjournals.org/content/25/21/2839.full
インストール: curl -O http://genome.gsc.riken.jp/osc/english/software/src/tagdust.tgztar zxvf tagdust.tgz cd tagdust/ make sudo make install rehash
使いかた: tagdust adapter.fasta input.fastq -fdr 0.05 -o output.clean.fastq -a output.artifactual.fastq
解説: 入出力形式は fastq/a が使える。リード全体を除く。速い。アダプター配列を fasta 形式で入力できるのが地味に便利で、これに対応しているものがなかなかない。Muth–Manber algorithm (Approximate multiple string search) を利用。FDRを指定できる。GPL3

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そこで、新しく1細胞RNA-Seqを始める方へ、僕達が理想だと考えている技術導入の手順を紹介したいと思います。また我々の方法は1細胞(6-14 pg Total RNA)だけでなく pg-ng オーダーの少量RNAからシーケンスが可能です。そのような方も以下の手順が参考になると思います。 0. 1細胞/微量RNA-Seqが本当に必要なのか検討する 1細胞/微量RNA-Seqでは、現時点でQuartz-Seqが世界最高の性能を持っている訳ですが、十分なサンプルを用意し、通常のRNA-Seqしたほうが、より精度の高いデータが得られます。なので、基本的には、サンプルをたくさん集める方法をしっかり検討すべきです。まずは、戦略面と技術面で1細胞/微量RNA-Seqが本当に必要かを検討する基準について書きます。 0.1. 戦略面での検討 あなたが抱えているプロジェクトが、1細胞/微量RNA-Seqでなければアプローチできないかどうかを問い直すことが重要です。
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a. 細胞状態が連続的に変化し、さまざまな細胞状態が、細胞集団に含まれている場合 (振動現象、ゆらぎなど) b. 細胞状態を特定するマーカーがほどんどわかっていない場合
最初から細胞状態が2状態しかないことが明らかで、しかも細胞状態を代表する遺伝子が分かっている、という状況では、FACSなどで cell sorting し、目的の細胞を採取することを考えるべきです。そして、微量RNA-Seqや通常のRNA-Seqで、しっかりと biological replication を取る方が良いでしょう。微量になると、テクニカルなノイズが増えるために、生物学的な差を知るためには、n を…