Hacking is believing

はじめに 新しい高精度な1細胞RNA-Seq, Quartz-Seq論文を出してから、各方面から多く相談を受けています。 Sasagawa Y and Nikaido I, et. al .  Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA-Seq reveals non-genetic gene expression heterogeneity . Genome Biology. 14. 2013  そこで、新しく1細胞RNA-Seqを始める方へ、僕達が理想だと考えている技術導入の手順を紹介したいと思います。また我々の方法は1細胞(6-14 pg Total RNA)だけでなく pg-ng オーダーの少量RNAからシーケンスが可能です。そのような方も以下の手順が参考になると思います。 0. 1細胞/微量RNA-Seqが本当に必要なのか検討する 1細胞/微量RNA-Seqでは、現時点でQuartz-Seqが世界最高の性能を持っている訳ですが、十分なサンプルを用意し、通常のRNA-Seqしたほうが、より精度の高いデータが得られます。なので、基本的には、サンプルをたくさん集める方法をしっかり検討すべきです。まずは、戦略面と技術面で1細胞/微量RNA-Seqが本当に必要かを検討する基準について書きます。 0.1. 戦略面での検討 あなたが抱えているプロジェクトが、1細胞/微量RNA-Seqでなければアプローチできないかどうかを問い直すことが重要です。 基本的には以下の2つの状況で、1細胞/微量RNA-Seqが役に立ちます。 a. 細胞状態が連続的に変化し、さまざまな細胞状態が、細胞集団に含まれている場合 (振動現象、ゆらぎなど) b. 細胞状態を特定するマーカーがほどんどわかっていない場合 最初から細胞状態が2状態しかないことが明らかで、しかも細胞状態を代表する遺伝子が分かっている、という状況では、FACSなどで cell sorting し、目的の細胞を採取することを考えるべきです。そして、微量RNA-Seqや通常のRNA-Seqで、しっかりと biological replication...

RNA-seq のデータから、統計的に有意な変動を示す遺伝子をどのように得るか。Microarray ときにも散々議論されましたが、RNA-seq でも同じく議論になっています。現在提案されている手法についてまとめてみました。 まだ全部には目を通せてません。すべて読んだ後に解説を書くかもしれませんが、網羅している自信がないので、先にリンクを列挙しておきます。主に論文とツールのソースコード、マニュアルなどです。ほかに情報をお持ちの方は教えてくださいな。 1. cufflinks と cuffdiff http://cufflinks.cbcb.umd.edu/howitworks.html の後半に cuffdiff の説明がある。 FPKM Trapnell C, Williams BA, Pertea G, Mortazavi AM, Kwan G, van Baren MJ, Salzberg SL, Wold B, Pachter L. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology doi:10.1038/nbt.1621 http://dx.doi.org/10.1038/nbt.1621 Jensen–Shannon divergence http://en.wikipedia.org/wiki/Jensen%E2%80%93Shannon_divergence 以下の3つも知っておいたほうが理解しやすい良い。 RPKM Ali Mortazavi, Brian A Williams, Kenneth McCue, Lorian Schaeffer and Barbara Wold Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq Nature Methods, volume 5, 621 - 628 (2008) http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n7/abs/nmeth.1226....